直接法耐药性检测

　　明确采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌以及六种β-内酰胺类抗生素耐药性检测实验程序和相应的操作。

　　1.仪器

　　基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、离心机、移液器、振荡器。

　　2. 试剂耗材

　　（1）仪器校正标准品：可采用不同型号厂家自带校正品，市售校正品进行仪器校正，校正质量范围为100-1000 Da。

　　（2）基质：-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）。

　　（3）色谱级乙醇、甲酸、三氟乙酸、乙腈；18兆欧超纯水。

　　（4）1.5ml离心管，接种环，废液缸，吸头（10μl、200μl、1ml）。

　　3. 试剂配制

　　（1）基质溶解液：超纯水与乙腈按1:1的比例混合，加入三氟乙酸（TFA），使其在溶液中的浓度为2.5%，现用现配。

　　（2）基质饱和溶液：按需取相应体积的基质溶解液，多次少量加入基质粉末，每次加入后均震荡溶解，直到基质不再溶解后停止加入基质，2000g离心，上清备用。

　　（3）氯化锌储备液（10mg/mL）：10mg氯化锌溶于1mL超纯水中。

　　（4）20mL 10×碳酸氢铵溶液：158.1mg碳酸氢铵溶于20mL超纯水中，充分混合，pH应为8～9，无需进一步调整。

　　（5）氯化锌工作液：取1mL 10×碳酸氢铵溶液加入9mL水中，加入10μL氯化锌储备液，配成10μg/mL氯化锌工作液，混匀。

　　（6）PBS溶液：市售PH7.4标准溶液或自行配置。

　　4. 检测流程

　　（1）细菌培养：用不同菌株适宜的常规培养基及培养条件培养至对数生长期。

　　（2）样本制备

　　鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药检测中，亚胺培南溶于PBS溶液中，其他β-内酰胺类抗生素溶于10μg/mL氯化锌工作液中。

　　将菌株培养到对数生长期，吸取50μL抗生素溶液于1.5mL离心管中，用1μL接种环刮取3-5个单克隆（大约3×108-6×108/mL）置于有抗生素溶液的离心管中，充分混匀，放于空气浴摇床中，根据抗生素种类不同，按表1中的时间孵育培养。取出培养物，室温2000 rpm，离心2min，上清备用。

表1  抗生素与细菌作用浓度及时间表

　　（3）点靶：用移液器吸取1μl制备的上清溶液，点到质谱样本靶上，室温自然干燥；吸取饱和基质溶液1μl覆盖到靶板上的样本点上，室温自然干燥。

　　（4）质谱检测：将样本靶放入质谱中，根据不同型号设备的使用要求进行参数调整及采集数据，并保存到相应的自定义文件中。

　　5. 结果判定

　　采用所使用的MALDI-TOF MS系统的谱图分析软件提取峰列表或标峰谱图，根据鉴定目的采用对应的检测结果表格判定抗性。

表2  鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药性检测特征峰

表3  β-内酰胺类抗生素敏感与耐药特征峰