采用本研究构建的数学模型,用MALDI-TOF MS鉴定甲氧西林敏感(MSSA)与抗性(MRSA)金黄色葡萄球的实验程序和相应的操作。
1.仪器
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、离心机、移液器、振荡器。
注意:因该分析模型时间基于ClinProTools软件构建的,该软件是布鲁克公司开发并仅适用于布鲁克质谱产生的原始数据,因此需要使用布鲁克MALDI-TOF MS系列质谱,并配有ClinProTools 分析软件。
2. 试剂耗材
(1)仪器校正标准品:可采用大肠埃希菌、不同型号厂家自带校正品,市售校正品进行仪器校正,校正质量范围为2,000-20,000Da。
(2)基质:-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。
(3)试剂:色谱级乙醇、甲酸、三氟乙酸、乙腈;18兆欧超纯水;
(4)耗材:1.5ml离心管,接种环,废液缸,吸头(10μl、200μl、1ml)。
3. 试剂配制
(1)基质溶解液:超纯水与乙腈按1:1的比例混合,加入三氟乙酸(TFA),使其在溶液中的浓度为2.5%,现用现配。
(2)基质饱和溶液:按需取相应体积的基质溶解液,多次少量加入基质粉末,每次加入后均震荡溶解,直到基质不再溶解后停止加入基质;2000g离心,上清备用。
(3)70%甲酸提取液:根据使用量,采用超纯水与甲酸配制成70%的甲酸溶液,现用现配。
4. 检测模块安装
将本项目开发的金黄色葡萄球菌MRSA/MSSA检测模块拷贝到任意目录下。
5. 检测流程
(1)菌株培养:按金黄色葡萄球菌的培养要求培养。
(2)样本制备:为确保生物安全及鉴定效率,不提倡直接涂抹法,建议使用乙醇/甲酸提取法进行样本制备;应在生物安全柜中进行样本制备。
用接种环刮取单菌落或按需刮取适量的菌胎;将刮取的病原菌,置于含有200μl超纯水的离心管中,混匀;加入600μl的乙醇,混匀;12000g离心2分钟,弃掉上清;沉淀中加入50μl 70%的甲酸溶液,混匀,加入50μl乙腈,混匀;12000g离心2分钟,取上清备用。
注意:可根据菌量调整超纯水与乙醇的使用体积,但需保证两者的体积比为1:3;可根据沉淀量调整70%的甲酸和乙腈的使用体积,但需保证两者的体积比为1:1。
(3)点靶:用移液器吸取1μl制备的样本溶液,点到质谱样本靶上,室温自然干燥;吸取饱和基质溶液1μl覆盖到靶板上的样本点上,室温自然干燥。
(4)质谱检测:将样本靶放入质谱中,根据各自使用的仪器型号调整参数,检测范围为2000-20000 Da,采集数据,确保谱图累计叠加峰强度在10000以上,并保存到相应的自定义文件中。
6. 结果检索及判读
打开ClinProTools软件,将本研究开发的检测模型调入软件,采用Classify功能,调入采集的待分析原始数据,点击确定进行分析,结果列表中1代表MRSA,2代表MSSA。