（一）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分，由纸片中心向周围扩散，形成递减药物浓度梯度。在纸片周围可抑菌浓度范围内，测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感性程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC值越小。根据抑菌圈直径解释标准折点，判定为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。
（二）材料与方法
1．培养基 采用水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）培养基，兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2~7.4。琼脂平板厚度为4mm，配置好的琼脂平板应置于密封塑料袋中4℃保存，使用前应将平板放置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
2．抗菌药物纸片 购买合格的商品药敏纸片。药敏纸片应保存于干燥环境，–20℃以下冷冻保存。β-内酰胺类药物的纸片应密封冷冻保存。少量日常工作用的纸片可冷藏保存于2~8℃冰箱，至多用1周。有些不稳定的抗菌药物（如碳青霉烯类、加克拉维酸的β-内酰胺类复合制剂等）须冷冻保存，用时取出。纸片在使用前1~2h自冰箱取出，平衡至室温再打开，以避免出现冷凝水。纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中。纸片必须在有效期内使用，过期应弃去。
3．标准比浊管 使用电子比浊仪或者0.5麦氏(McFarland)标准比浊管，标定接种菌液浓度。具体操作同稀释法。
4．接种物制备 挑取经过35℃，16~24h孵育的纯培养物，用直接菌落悬液法或肉汤增菌法制备菌悬液，制备好的菌液须在15分钟内使用。
（1）直接菌落悬液法：取纯培养物直接接种于无菌生理盐水或MH肉汤（MHB），使浊度至0.5麦氏浊度单位（1.5×108cfu/ml）。对于黏液型菌株、干燥型菌株及在盐水中自凝菌株，可配成高浓度菌液，经沉淀后取上清液稀释至0.5麦氏浊度单位。
（2）生长法：取纯培养物接种MHB，35℃孵育4~6h，使浊度达到0.5麦氏浊度单位，浊度超过时可用无菌生理盐水或MHB稀释。在无法用菌落制备直接菌落悬液时可使用此方法。它也可用于非苛养菌(葡萄球菌除外)的新鲜菌落(24h)直接菌落悬液方法无法进行时。
5．接种平板 用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，挤出过多的菌液，然后在MH平板表面反复均匀涂抹3次，每涂一次旋转平板60°以保证接种菌涂布均匀，最后沿平板内缘涂抹一周。涂布完毕后，置室温干燥3~5分钟。
6．贴药敏纸片 在15分钟内用无菌镊子或分配器将纸片贴于平板表面，并确保纸片与平板表面完全接触；各纸片中心距离不小于24mm，通常一个直径90mm的平板贴4～6个纸片为宜，直径150mm平板至多可贴12个纸片。纸片一旦贴上，药物会立即扩散，因此纸片贴好后不能再移动。
7．孵育 贴好纸片后，15分钟内须把琼脂平板倒置放入孵箱孵育。叠放琼脂平板不超过3个。根据待测菌株种属的不同和待测药物的不同选择孵育条件，详见表2-3-1。
8．结果判读 菌液浓度合适且涂布均匀，细菌呈融合生长，抑菌圈呈透明环状。手持平板用卡尺、普通尺或特制的量具在平板背面量取抑菌圈直径。测量抑菌圈直径应包括纸片直径，肉眼观察无明显生长的地区作为抑菌圈边缘，在抑菌圈边缘借助放大镜才能观察到的微小菌落生长可忽略不计。甲氧苄啶和磺胺类药物抑菌圈内可允许出现菌株轻微生长；因此，在测量抑菌圈直径时可忽视轻微生长（20%或较少的菌苔）而测量较明显抑制的边缘。测量单位为毫米，小数点后数据四舍五入。
9.某些细菌抑菌圈判读特殊要求：
（1）肠杆菌目、铜绿假单胞菌、不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、霍乱弧菌：用反射光阅读，从平板背面测量。变形杆菌可迁徙到某些抗菌药物抑菌圈内生长，因此变形杆菌抑菌环内由于迁徙出现的淡淡云雾样生长可忽略不计。
（2）葡萄球菌和肠球菌：用反射光阅读，从平板背面测量，但利奈唑胺、苯唑西林、万古霉素需用透射光阅读（平板正对光源），在抑菌环内任何可辨别的菌落生长提示苯唑西林、利奈唑胺或万古霉素耐药。
（3）一般若在清晰的抑菌圈内有独立的菌落生长，则提示可能接种物不纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验，但此菌落也可能为抗菌药物选择出的突变耐药株。
（4）某些细菌的磺胺类药的抑菌圈内可能有微量的细菌生长，可以忽略不计，应以外抑菌圈的直径为准。
（5）对于溶血性细菌、产色素的细菌，应注意测量细菌生长受抑制的区域，而不是溶血区域或者色素扩散的区域。
（三）质量控制
纸片琼脂扩散法药敏试验常用质控菌株包括金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212、大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218和铜绿假单胞菌ATCC27853等，常规工作中应按要求进行质量控制，质控菌株的抑菌圈直径应落在允许范围内，如果超出该范围，应及时查找原因并纠正。由于质控菌株的抑菌圈较大，因此在直径90mm的平板上贴不超过4个纸片为宜。
（四）影响因素
1．培养基成分 培养基的成分对结果影响很大，蛋白胨内含有对氨基苯甲酸（PABA），可中和磺胺类药物的作用。培养基中如含有胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶可使三甲氧苄氨嘧啶（TMP）失去活性。
二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）的浓度变化将影响氨基糖苷类、四环素、多黏菌素等抗菌药物对假单胞菌的试验结果。
2．培养基pH 标准方法pH7.2~7.4。培养基pH影响抗菌药物活性，可导致结果误差。红霉素和氨基糖苷类在酸性条件下对金黄色葡萄球菌的抗菌活性减低，在碱性条件下则会增强；而四环素和头孢菌素类在酸性条件下抗菌活性增加，在碱性条件下则减低。
3．培养基厚度 标准方法培养基厚度4mm，一般允许有±1mm的误差，整体厚度要求均匀一致。培养基厚薄主要影响药敏纸片中药物扩散后所形成的梯度浓度（μg/cm3）以及细菌生长的营养状况。抗菌药物自纸片向培养基中呈球面状扩散，培养基越厚，纸片周围培养基中药物的浓度（μg/cm3）越低，抑菌圈就越小，反之，培养基越薄，则纸片周围药物浓度越高，抑菌圈就越大。
4．培养基中琼脂浓度 标准方法17g/L。琼脂浓度大小主要影响抗菌药物扩散速率，琼脂是从海藻中提取出来的一种复合多糖物质，含有酸性硫酸盐基团。具有阳离子分子结构的抗菌药物（如多黏菌素、氨基糖苷类等）可与琼脂中酸性硫酸盐基团结合，这样抗菌药物在琼脂培养基中的扩散速度就减慢，因而不同程度影响抑菌圈的直径。
5．接种物浓度 标准方法1.5×108CFU/ml。接种物浓度大小，是引起纸片扩散法药敏试验误差主要因素之一，单位面积上细菌接种量越小，形成的抑菌圈越大。根据有关试验，若低于标准接种物浓度则抑菌圈直径误差较大，但稍高时，误差相对较小。对0.5号麦氏标准比浊管应定期校正或配制，因为比浊管随时间延长，其颗粒易变粗大，从而导致接种物浓度的偏低。对比浊仪的校准应纳入实验室的常规工作程序，每次实验前要先进行校准，并有记录。
6．纸片含药量 纸片含药量也是影响纸片扩散法药敏试验结果重要因素之一，根据试验，纸片含药量低于规定标量的50%时，则对抑菌圈直径影响较大，含药量高于标量50%以内，则对抑菌圈直径相对影响较小。因此，应定期进行质控。
药敏纸片应保存于干燥环境，可在4℃下冷藏，或-20℃以下冷冻保存，在使用前1~2 h从冰箱取出，平衡至室温再打开，以避免出现冷凝水。有些不稳定抗菌药物（如亚胺培南、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂等）须冷冻保存，用时取出。新购纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的塑料袋中。纸片只能在有效期内使用，并定期做质控，过期应弃去。
7．预孵育时间 尽管标准方法未作预孵育规定，但是要求幼龄菌悬液涂布平板后，须待其表面水分完全被培养基吸收再贴纸片，该过程实际上就是预孵育。实验证明预孵育时间与抗菌药物抑菌圈之间具有非常显著的负相关关系。建议常规工作中预孵育时间不宜超过15分钟。