在肉汤或者琼脂中将抗菌药物作不同浓度梯度的稀释后，接种一定浓度的受试菌，通过测试细菌在含不同浓度梯度药物培养基内的生长情况，受试菌肉眼未见生长的最低药物浓度，即为该药物的最低抑菌浓度(MIC)。稀释法包括肉汤稀释法和琼脂稀释法，肉汤稀释法又包括大量肉汤稀释法、常量肉汤稀释法和微量肉汤稀释法，此处仅介绍微量肉汤稀释法和琼脂稀释法。
微量肉汤稀释法
(1) 抗菌药物贮存液制备：药敏试验的药物必须选择使用抗菌药物标准品或有明确标示纯度及效价的参考药品。抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物粉剂量或贮存液体积可根据下述公式进行计算。
注：药物的效能即药物的效价（纯度）。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗菌药物贮存液，所用抗菌药物为粉剂，其药物的效能为750μg/mg。用分析天平精确称取抗菌药物粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需贮存液体积为：（182.6 mg×750μg/mg）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗菌药物粉剂溶解于少量体积（几滴或几毫升）溶剂中，再加稀释剂至总量107.0ml。对大多数稳定、且不易降解的抗菌药物，将未用完的储液分装至无菌小管，置于-70℃或更低温度贮存，时限为6个月。每次使用取一管，避免反复冻融影响其活性。抗菌药物储液的稀释：采用倍比稀释法制备一系列所需抗菌药物检测梯度。常见抗菌药物溶剂和稀释剂详见表2-4-1。
(2) MIC板：可用经批准认可的商品试剂盒或自己制备。自己制备：无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔100μl，第12孔不加药作为生长对照，-20℃(最好≦-60℃)以下密封保存备用。
(3) 标准比浊管：使用电子比浊仪或者0.5麦氏(McFarland)标准比浊管，标定接种菌液浓度。比浊管配制方法：取0.048mol/L的氯化钡 (1.175%w/v BaCl2·2H2O)0.5ml，加到99.5ml的0.18mol/L硫酸（1%v/v）溶液中并不断搅动以维持混悬状态，制成比浊管。用光径1cm的分光光度计测定吸光度来标定标准比浊管。0.5麦氏标准比浊管在625nm波长的吸光度应为0.08~0.1。选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4~6ml。将试管帽拧紧，置于室温暗处保存。在使用前，应将比浊管置于旋转混匀器上充分混匀。若有大颗粒出现，应更换。每6个月应更换标准比浊管或对其浓度进行复验。
(4) 接种物制备及MIC板接种：将用生长法或直接菌落悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MHB 1∶20稀释后，向每孔中加10μl。同时做一个生长对照和无菌（未接种）对照，并建议将菌悬液接种至非选择性琼脂平板培养，以检查接种菌悬液的纯度和进行培养物的菌落计数。
(5) 孵育：将已接种的微量MIC孵箱孵育。微量MIC板叠放一般不超过4个，以便保持所有培养物的孵育温度相同。为防止干燥，孵育前应将每个微量MIC板置于密封装置中，如塑料盒中。对于苛养菌和特殊耐药表型的检测，其孵育条件有所不同，应按相应要求实施。
(6) 结果判读：在读取所测试菌株的MIC前，应检查生长对照孔的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，菌量是否符合要求，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。肉眼观察，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照孔比较抑制80%细菌生长孔药物浓度为受试菌MIC。当微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
琼脂稀释法
琼脂稀释法是将不同浓度的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量琼脂培养基中，制成含不同抗菌药物浓度的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，肉眼观察以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度判为MIC。该法优点是可在一个平板上同时作多株细菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌。
(1) 培养基：对于一般非苛养菌，选择MHA干粉，某些营养要求高的苛养细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌属等，MHA培养基须加入相应补充物质或使用特殊培养基。
(2) 抗菌药物：药敏试验的药物必须选择使用抗菌药物标准品或有明确标示纯度及效价的参考药品。抗菌药物制备和稀释同肉汤稀释法。
(3) 标准比浊管：使用0.5麦氏标准比浊管，配制方法见纸片扩散法。
(4) 含药琼脂平板制备：根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热融化，并在45~50℃水浴中平衡的琼脂培养基中，充分混匀倾倒灭菌平板，琼脂厚度约4mm（90mm直径平板倾琼脂总量为25ml）。通常按1:9（或1:19）比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天（易失效的药物应及时使用）。
(5) 接种物制备与接种：用生长法或直接菌落悬液法制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释。含药琼脂平板使用前，从2~8℃冰箱取出置35℃孵箱30分钟，待含药琼脂平板表面水分干燥后进行接种。以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，形成直径为5~8mm的菌斑，每个菌斑含菌数约为104CFU。接种顺序是先接种无药对照平板，而后从低药物浓度向高药物浓度平板。
(6)孵育：琼脂平板接种好菌液后，将平板置室温待菌液被琼脂吸收后（一般不超过30分钟）把琼脂平板倒置放入孵箱孵育，观察结果。
(7)结果判读：将平板置于暗色、无反光物体表面判读试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄氨嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为MIC。接种处出现单个菌落或模糊薄雾状可忽略不计。
（三）质量控制
用于稀释法药敏试验的质控菌株包括金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌ATCC43300；粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC 51299；肺炎链球菌ATCC49619；大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC 35218；铜绿假单胞菌ATCC27853；流感嗜血杆菌ATCC49247、流感嗜血杆菌ATCC 49766；淋病奈瑟菌ATCC49226。按质量控制要求进行质量控制，质控菌株的MIC值应落在允许范围内，如果超出该范围，应及时查找原因并纠正。
（四）注意事项
1．抗菌药物的质量须保证，应为直接购自中国食品药品检定研究院或相关机构的药物标准品。实际浓度需根据原料说明书的纯度和效价进行换算。
2．肉汤稀释法如果出现单一的跳孔现象，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度；如出现连续或不连续的多处跳孔，或琼脂稀释法出现低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，应检查操作流程中可能出现问题的环节，重新试验。